在Cluster3中，免疫细胞的Th2细胞、TFH、DC、pDC、CD8 T细胞可能是与预后相关的细胞，在Cluster4中，NK cd56带细胞可能是与预后相关的细胞。大多数与预后相关的免疫细胞仅在一个IGAS集群中具有预后意义。这些根据结果得出，免疫细胞有能力作为IGAS集群的预后指标。

  异常免疫基因相关选择性剪接 (IGAS) 模式在发病机制、进展和肿瘤微环境中起着关键作用。选择性剪接 (AS) 在肿瘤发展和肿瘤微环境 (TME) 形成中起着至关重要的作用。然而，乳腺癌转录后机制的 IGAS 模式仍然有限。

  本研究从TCGA SpliceSeq中获得了 mRNA AS 模式的全面而详细的视图。从TCGA数据库中获取了乳腺癌的 RNA-Seq 数据和相应的临床病理学特征。从GEO数据库中下载了验证队列 GSE20685的 mRNA 表达谱和临床信息。 本研究技术路线如图所示。

  本研究在乳腺癌患者中确定了 4908 个基因的 11,307 个 AS 事件，其中ES 是最常见的 AS 类型（图 1A）。差异 AS 分析显示了 3925 个基因的多达 8000 个 DSAS 事件，其中 ES 也是所有失调 AS 事件中最常见的类型，其次是 AP、AT、RI、AD、AA 和 ME。图 1B 证明了 4-5 种类型的 AS 模式能出现在 DSAS 的特定亲代基因（两个橙色部分）中，例如 RASSF7、MOK、IL32 和 NR1H3。本研究使用差异表达分析确定了 DEIG，并观察到超过一半的 DSAS 亲本基因属于 DEIG，称为 IGAS 亲本基因（图 1C）。作者还研究了 DSAS 和 IGAS 亲本基因在染色体上的分布，发现它们在 Chr1、Chr2、Chr17 和 Chr19 上占优势，而没再次出现在 ChrY 上（图 1D ）。最终，本研究基于 IGAS 亲本基因在 DSAS 事件中提取了 4464 个差异剪接的 IGAS 事件作为后续分析的主题（图 1E）。

  为了研究 IGAS 事件与患者 OS 之间的关系，本研究对 4464 个差异剪接的 IGAS 事件进行了单因素Cox 回归分析，在 354 个基因中发生了多达 489 个与生存相关的 IGAS 事件，在所有与生存相关的 IGAS 事件中，AP、ES 和 AT 是 TOP3 最常见的类型。为了获得最终的 IGAS 预后模型，本研究选择了每种 AS 类型的所有独立的预后相关 IGAS 事件，并通过 LASSO 惩罚多元回归进一步评估它们作为候选者。根据结果得出，所有 AS 类型的最终预后模型都显示出区分乳腺癌好坏结果的显著能力（图 2A–C）。ROC 曲线证实，最终的 IGAS 预后模型比特定 AS 类型的其他预后模型具有最高的效率（图 2D ）。其中DAPL1、MAATS1 和 AKR1C2 中发生的多个与预后相关的 IGAS 事件诱导了良好的存活率。上述结果强烈表明 IGAS 事件不仅仅具备重要的生物学功能，而且具有潜在的临床价值。

  接下来本研究使用 Cox 回归分析评估 IGAS 预后模型对具有完整临床病理学特征的乳腺癌患者的独立预测价值。单因素Cox 回归和多因素Cox 回归分析都表明了IGAS 预后模型是一个强有力的预后因素。本研究还发现 IGAS 临床诺模图预测的概率与 OS 预测的理想参考线显示出最佳一致性（图 2E-H）。

  鉴于SF在AS事件中的重要调控作用，本研究建立了AS调控网络，探索DESFs与差异剪接IGAS事件之间的关系。首先本研究在乳腺癌中鉴定出36个表达异常的desf(图3A)。然后本研究使用Spearman相关分析识别了DESF 之间的共表达关系，发现RBM5与6个DESF 显著相关(图3B)。此外本研究通过计算IGAS事件的PSI值与DESFs表达水平之间的相关性，构建了AS调控网络。图3C展示了AS调控网络，该网络包含721个节点和1183条边。一个IGAS事件可以被多个SF调节，这反映了SF之间复杂的合作或竞争关系，解释了由几个SF产生的AS事件的多样性。

  本研究还确定了三个与生存相关的 SF，包括 ESRP1、RBM5 和 SRSF5（图 3D），AS调控网络的枢纽节点RBM5和SRSF5低表达预示预后不良。本研究还发现所有与生存相关的 SF 都与每个预后模型密切相关（图 3E），在三个生存相关的 SF 中，ESRP1 与所有预后模型呈正相关，RBM5 和 SRSF5 呈负相关，与生存分析一致。

  本研究进一步描述了免疫细胞与 IGAS 预后模型的关联，特别是风险组中免疫细胞浸润水平的差异以及与 IGAS 预后特征的相关性 。结果观察到一些 IGAS 预后特征与免疫细胞显著相关且相关趋势一致（图 4A ）。本研究还发现 T 淋巴细胞，尤其是 Th1 细胞、细胞毒性细胞和 T 细胞，与一系列 IGAS 预后特征具有显著相关性。此外，ARRB2 与 Th1 细胞、细胞毒性细胞和 T 细胞的大多数标记基因之间也存在统计学显著相关性（图 4B）。先前的研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 是重要的预后指标 ，而免疫浸润水平的增加可降低死亡和复发的风险。在一定程度上，IGAS 预后特征和免疫细胞（特别是 TILs）的浸润水平都解释了 IGAS 风险组总体生存率的显著差异。

  为了研究 IGAS 预后模型在临床治疗中的价值，本研究探讨了免疫治疗和化疗在不同风险人群中的可能性。使用 TIDE 评估了免疫疗法在不同 IGAS 风险组中的潜在临床疗效（图 5A），结果显示尽管 IGAS 风险组的 TIDE 评分没有显著差异，但低风险组的微卫星不稳定性 (MSI) 更高，而且低风险组的T细胞功能障碍评分高于高风险组。本研究进一步应用 Submap 算法来预测免疫检查点阻断（CTLA-4 和 PD-1）的治疗效果。结果表明，免疫浸润水平较高的低风险组患者对抗 PD-1 免疫疗法的敏感性更高（图 5B）。TIL 中受 PD-1 和 PD-L1 控制的免疫细胞的存在可能是免疫检查点抑制剂发挥作用的先决条件 。

  考虑到化疗是乳腺癌的常见治疗方法，本研究试图评估代表性化疗药物对 IGAS 风险组患者的反应。与高风险组相比，所有五种化疗药物都可以观察到对低风险组具有显著的反应敏感性（图 5C）。研究表明，肿瘤内和肿瘤周围 TIL 水平的逐渐增加预示着患者对化疗的反应和生存率会提高， IGAS风险人群对免疫治疗和化疗的敏感性差异有望受益于临床治疗，进一步指导乳腺癌患者的个体化用药。

  研究结果表明，与预后相关的 IGAS 事件在个体水平上差异很大，为了区分 AS 的不同模式，本研究使用一致性无监督聚类方法对与预后相关的 IGAS 事件进行了聚类。定义了具有稳健分类的四个 IGAS 集群的一致性矩阵（图 6A）。为了评估 IGAS 集群在总体生存方面的差异，本研究应用 Kaplan-Meier 分析来确定不同 IGAS 集群的生存能力。如图 6B 所示，IGAS 簇具有显著不同的预后，具备极其重大的异质性，其中 Cluster1 和 Cluster4 均与患者预后不良相关，而 Cluster2 与患者预后良好相关。本研究还发现 IGAS 簇具有不同的 IGAS 预后特征（图 6C）。通过进一步比较 IGAS 簇之间的免疫特征，本研究发现 Cluster2 和 Cluster4 具有更高的免疫评分，而 Cluster1 和 Cluster3 具有更高的基质评分（图 6D）。

  考虑到免疫细胞的重要作用，本研究评估了它们在IGAS集群中的浸润差异和预后能力。 在IGAS聚类中，每种免疫细胞类型表现出极显著的差异(图7A,B)。聚类分析表明，三种IGAS聚类中免疫细胞的预后意义是显著的、多样的，甚至相反的(图7C)。除Cluster2外，每个IGAS聚类中都可以有一个或多个免疫细胞作为预后相关细胞。例如，在Cluster1中，免疫细胞的Treg、Th1细胞、Tgd、DC、pDC、aDC细胞可能是与预后相关的细胞;在Cluster3中，免疫细胞的Th2细胞、TFH、DC、pDC、CD8 T细胞可能是与预后相关的细胞，在Cluster4中，NK cd56带细胞可能是与预后相关的细胞。大多数与预后相关的免疫细胞仅在一个IGAS集群中具有预后意义。这些根据结果得出，免疫细胞有能力作为IGAS集群的预后指标。

  本研究基于 IGAS、TME、预后和免疫/化疗确定并表征了乳腺癌的转录后机制。筛选了差异剪接的 IGAS 事件并构建了 IGAS 预后模型，可用作独立的预后因素。此外，AS 调控网络表明剪接因子与 IGAS 事件之间存在复杂的合作或竞争关系，这解释了剪接异构体的多样性。超过一半的免疫细胞在 IGAS 风险组中表现出不同程度的浸润，IGAS 的预后特征与免疫细胞类型的浸润水平表现出显著且一致的趋势相关性。IGAS 风险组在免疫疗法和化学疗法的敏感性方面表现出显著差异。最后，由无监督聚类分析定义的 IGAS 聚类具有不一样的预后模式，表明 IGAS 事件的本质异质性。这篇综合分析明显地增强了对乳腺癌 IGAS 模式和 TME 的理解，这可能有助于阐明 IGAS 在肿瘤形成中的潜在机制，并为肿瘤发生和进展的分子机制提供线索。本研究的缺陷主要在于，在临床意义和实施上仍然需更多数据的支持。